PCR引物设计中,引物上是否需要每个碱基都与模板链结合?为了得到想要的Tm值,或是保证长度,不产生二聚体等,可不可以有在引物上添加一些不配对的碱基?如下图:可以的话,会对扩增有影响么?
来源:学生作业帮助网 编辑:作业帮 时间:2024/07/02 16:20:09
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PCR引物设计中,引物上是否需要每个碱基都与模板链结合?为了得到想要的Tm值,或是保证长度,不产生二聚体等,可不可以有在引物上添加一些不配对的碱基?如下图:可以的话,会对扩增有影响么?
PCR引物设计中,引物上是否需要每个碱基都与模板链结合?
为了得到想要的Tm值,或是保证长度,不产生二聚体等,可不可以有在引物上添加一些不配对的碱基?
如下图:
可以的话,会对扩增有影响么?
如果不可以,为什么?
PCR引物设计中,引物上是否需要每个碱基都与模板链结合?为了得到想要的Tm值,或是保证长度,不产生二聚体等,可不可以有在引物上添加一些不配对的碱基?如下图:可以的话,会对扩增有影响么?
可以在引物上添加不配对的碱基,但是在引物的3‘端,至少有三个碱基是严格配对的.但是这样的操作主要是为了添加酶切位点或者flag等.
Tm值是根据两条链的退火情况来计算,不配对的碱基不算在内,所以你添加不配对的碱基对于Tm值几乎没有影响.
保证长度--没有必要添加不配对的碱基.
不产生二聚体--也没有必要,引物自身的碱基配对对于扩增影响不大,引物间的二聚体可以根据引物位置的选择来避免,无法避免时要保证3’端无配对.
所以不建议添加不必要的碱基来设计引物.(某些干扰实验除外)
我觉得不一定需要,但是不配对的碱基数量要尽可能的少,而且关键位置如酶切位点或是活性位点等要尽可能保守。
引物3'端的碱基,特别是最末及倒数第二个碱基,应严格要求配对,以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
引物上的碱基不是每一个都必须与模板链互补配对的,但是像你图上所示的那种设计是不行的,一般引物的5‘端可以完全不与模板一样,这样你可以在PCR中引物酶切位点等,但是3’端必须是与模板链结合的,因为Taq酶是按5-3方向延伸的,3‘端如果翘起的话,是不能延伸下去的,如果你的引物3’端一段与模板下游某处能结合,那就变成了deletion某段的PCR了...
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引物上的碱基不是每一个都必须与模板链互补配对的,但是像你图上所示的那种设计是不行的,一般引物的5‘端可以完全不与模板一样,这样你可以在PCR中引物酶切位点等,但是3’端必须是与模板链结合的,因为Taq酶是按5-3方向延伸的,3‘端如果翘起的话,是不能延伸下去的,如果你的引物3’端一段与模板下游某处能结合,那就变成了deletion某段的PCR了
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